Материал с весьма оптимистичным подзаголовком «Генно-инженерный препарат от всех видов и стадий злокачественных опухолей пациенты могут получить через три-четыре года».
Однако любой человек, хоть сколько-нибудь знающий о терапии онкологических заболеваний, при виде такого прогноза в лучшем случае удивленно поднимет брови, а в худшем — возмутится. Рассказываем, что не так с очередной «научной сенсацией».
Что случилось?
Разработка препарата, о котором рассказали в «Известиях», ведется в Государственном научно-исследовательском институте особо чистых препаратов Федерального медико-биологического агентства (ФМБА) России. Замдиректора по научной работе института, член-корреспондент РАН и доктор медицинских наук, профессор Андрей Симбирцев, в этом материале под заголовком «В России создали лекарство от рака и проверили его в космосе» рассказал корреспонденту «Известий» о «белке теплового шока», который был кристаллизован в невесомости, на МКС, и теперь проходит доклинические испытания.
Сейчас исследования проводятся на грант Министерства образования и науки, а 100 миллионов рублей на клинические испытания ученые планируют найти с помощью частных инвесторов и программы государственного 50%-ного софинансирования. Чтобы его привлечь, разработчики собираются «стучаться во все двери, потому что препарат уникальный. Мы стоим на пороге открытия совершенно нового средства лечения рака. Оно позволит помочь людям с неизлечимыми опухолями».
«Мы уже изготавливаем препарат на производственных участках НИИ», — сообщает воодушевленным журналистам Андрей Симбирцев, добавляя, что в данный момент проходят испытания на мышах, а до пациентов он дойдет всего через три-четыре года.
В чем подвох?
Все это звучит очень вдохновляюще, однако белки теплового шока действительно известны давно, но люди почему-то до сих пор не сделали из них панацею от всех видов рака. Это довольно большое семейство белков, которые активируются в ответ на стресс при повышении (а иногда и при понижении) температуры. Они помогают клетке бороться с последствиями деградации структуры других белков. Самый известный пример такого изменения — сворачивание главного компонента яичного белка, альбумина, при жарке или варке, когда он из прозрачного становится белым. Так вот, белки теплового шока устраняют последствия этих изменений: «чинят» или окончательно утилизируют деградировавшие структуры. Многие белки теплового шока являются в то же время шаперонами, которые помогают другим белкам «сворачиваться» правильно.
Справка:
Шапероны — класс белков, основной функцией которых является восстановление третичной или четвертичной структуры белков, также они участвуют в образовании и диссоциации белковых комплексов.
Белки теплового шока есть во всех клетках. Однако в разных клетках (особенно опухолевых, которые сильно отличаются при разных видах рака как друг от друга, так и от нормальных клеток организма) эти белки ведут себя по-разному. К примеру, в одних видах рака экспрессия белка HSP-70 может быть как повышенной (при злокачественной меланоме), так и пониженной (при раке почки).
Чтобы понять, о каком белке идет речь и действительно ли он используется в терапии рака и может помочь при всех его видах, мы поговорили с доктором биологических наук Александром Сапожниковым . Этот ученый — руководитель лаборатории клеточных взаимодействий Института биоорганической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, которая занимается одним из самых перспективных для разработок в этом направлении белков теплового шока уже много лет. Он так прокомментировал эту статью:
«Я не скажу, что это бред, но это абсолютно некорректная информация. Автором идеи применения белков теплового шока с молекулярной массой 70 килодальтон (так называемые БТШ-70, по-английски HSP70) является мой друг и коллега Борис Маргулис. Он работает в Институте цитологии в Санкт-Петербурге.
Он и его жена Ирина Гужова занимаются этим белком всю жизнь (я тоже занимаюсь им много лет, но не исследованиями, связанными с терапией рака). Формально заведующей лабораторией является Ирина, она занимается изучением того, как белок связан с нейродегенеративными заболеваниями, а Борис — заведующий отделом. Он первый в мире человек, который предложил применять «голый», не нагруженный никакими опухолево-ассоциируемыми антигенами, белок.
Я не верил в его представления о таком применении этого белка (собственно, пока и не доказано, что это будет эффективно). Если «плясать от печки», есть некий индус, Прамод Сривастава , который в Индии родился, но учился, живет и работает в Америке. Он давным-давно сделал не просто «вакцину» против опухоли с помощью БТШ-70, но и открыл клинику и лечит ею онкологических больных. Сривастава выделяет этот белок прямо из опухоли: берет биопсию у пациентов, выделяет его из кусочков ткани (есть специальные способы получить очень высокую фракцию этого белка).
Однако белок, который получают из тканей онкологических больных, находится в прочной связи с опухоль-ассоциированными пептидами — теми признаками опухоли, которые распознает иммунная система. Поэтому, когда этот комплекс вводят больным, у большого количества больных вырабатывается иммунный ответ, и получается позитивный эффект для больного.
На самом деле, по статистике, этот эффект не превышает эффект от применения химиотерапии. Но все-таки химиотерапия «травит» организм, а вот такая «вакцинация» организм не «травит». Это очень давняя история, такой подход давным-давно применяется в клинике.
Александр Сапожников. Доктор биологических наук, профессор
Что касается Бориса Маргулиса, он (в частности, на базе моей лаборатории) показал (и опубликовал результаты своей работы), что если чистый белок, без всякой опухолевой нагрузки, добавить к опухолевым клеткам, то этот экзогенный белок заставляет опухолевые клетки выставлять на свою поверхность те самые опухолево-ассоциированные пептиды, которые в нормальном состоянии находятся внутри этих клеток, в цитоплазме. Тогда иммунная система их распознает, и организм будет своими силами отторгать эти клетки, бороться с опухолью.
Это было показано в культуре in vitro , то есть не в организме, а в пробирке. К тому же Борис Маргулис претендовал только на детские лейкемии, поскольку он связан с клиницистами в Питере. То, что Симбирцев в своем интервью сказал, — это уже расширение вот такого метода применения голого, чистого белка.
Механизм действия этого чистого белка — заставлять опухоль вытаскивать на поверхность (как сам Маргулис это назвал, «выдавливать») эти пептиды со своим эндогенным белком. Этот белок есть во всех клетках, и в мире нет ни единой клетки, у которой не было бы этого белка. Это очень древний, очень консервативный протеин, он есть у всех (о вирусах я не веду сейчас речи).
Сам Маргулис не потянул бы доклинические исследования, он получил (лет пять назад) грант совместно с Институтом особо чистых препаратов. В этом институте, видимо, и работает этот Симбирцев, его фамилию я слышал много раз, но коль скоро это Федеральное медико-биологическое агентство, к которому относится Институт иммунологии на Каширке, в котором я много лет работал, то, скорее всего, это Институт особо чистых препаратов, с которым он получил грант на доклинические исследования. В советские годы это было Третье управление Минздрава. Именно с этим институтом был получен грант на доклинику от Минобра на 30 миллионов на три года, который закончился два года назад.
Все бумажные дела Институт особо чистых препаратов сделал, они отчитались по своему гранту, что касается следующей стадии, продвижения препарата, там тоже нужны деньги. Это первая стадия клинических исследований. Тут Борис Маргулис, насколько я понимаю, уже отошел от разработок, отдав это на откуп Институту особо чистых препаратов.
Они делают этот белок, сделали биотехнологию, у меня он даже в холодильнике есть, Борис давал его для испытаний. Они в больших количествах его делают, хранят в лиофилизированной форме (в сухом виде), в стерильных ампулах. Собственно, этот препарат и надо, может быть с какими-то добавками, применять в клинических испытаниях. Но для этого нужны деньги.
Увидев случайно новость с интервью Симбирцева, я прочитал, послал Маргулису, спросил, читал ли он. Борис мне ответил, что Андрей (с которым он хорошо знаком) сделал какую-то глупость, даже не сослался на авторов. Автором этой идеи (применять чистый белок как противоопухолевый препарат в онкологии), повторюсь, является Борис Маргулис. Но, насколько я от него слышал в последнее время, он от этой проблематики отошел.
Я занимаюсь этим белком, но как иммуномодулятором, как и моя лаборатория. Мы немножко работали с противоопухолевыми свойствами, на мышиных моделях. Там действительно получились хорошие результаты. Я имею в виду «голый» белок, он просто обладает иммуностимулирующими свойствами. Кстати, еще большой вопрос, что является причиной его иммуностимулирующих свойств: сам белок или какие-то маленькие примеси, например липополисахариды. Этот белок получают в бактериальной культуре (в E.coli ), это самая распространенная техника получения рекомбинантных белков. Липополисахариды (ЛПС) — компонент клеточной стенки бактерий, и очистить культуру от этой примеси до конца очень сложно. Конечно, очищают, но какие-то мизерные концентрации остаются. Эти примеси ЛПС тоже обладают иммуностимулирующими свойствами просто потому, что иммунная система в процессе эволюции выработала свою защиту от бактерий. Как только «запах» бактерий появляется в организме, иммунная система активируется. Поэтому многие авторы сейчас считают, что иммуностимулирующие свойства этого белка, которые модулируют и противоопухолевый ответ, вызваны не БТШ как таковым, а его примесью. Но этот вопрос научный, дискуссионный и не имеет отношения к практике.
Сейчас, повторюсь, Борис Маргулис отходит от этой темы, от онкологии, и работает над малыми молекулами, которые способны регулировать продукцию этого белка. Он связался с химиками, которые умеют делать ингибиторы — такие специфические киназы, какие-то ферменты внутри клеток, которые прекращают их работу. Ингибиторы могут сказать какому-то ферменту: «Нет, ты не имеешь права работать».
Это делается очень просто: все ферменты имеют центр связывания с субстратом, и, если взять какую-то маленькую молекулу, которая встроится в этот центр связывания субстрата, он уже не сможет этот субстрат обрабатывать. Борис сейчас как раз занимается такими молекулами, которые ингибируют внутриклеточный синтез этого БТШ-70. И, действительно, такие молекулы очень актуальны, и не только для фундаментальной биологии, но и для практики, клинической медицины».
Генно-инженерный препарат от всех видов и стадий злокачественных опухолей пациенты могут получить через три-четыре года
В Государственном научно-исследовательском институте особо чистых препаратов Федерального медико-биологического агентства (ФМБА) России завершаются доклинические испытания «Белка теплового шока» — лекарства, которое может совершить революцию в онкологии. Это принципиально новое средство для лечения злокачественных опухолей, полученное с помощью биотехнологий. Ученые предполагают, что оно поможет людям с неизлечимыми сегодня опухолями. Успех в создании препарата был достигнут с помощью космического эксперимента. Об этом корреспонденту «Известий» Валерии Нодельман рассказал замдиректора института по научной работе, член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор Андрей Симбирцев.
- Что является основным действующим веществом нового лекарства от злокачественных образований?
Наш препарат имеет рабочее название «Белок теплового шока» — по основному действующему веществу. Это молекула, которая синтезируется любыми клетками организма человека в ответ на различные стрессорные воздействия. О ее существовании ученые знали давно. Первоначально предполагалось, что белок может только защищать клетку от повреждения. Позже выяснилось, что помимо этого он обладает уникальным свойством — помогает клетке показывать свои опухолевые антигены иммунной системе и тем самым усиливает противоопухолевый иммунный ответ.
- Если организм вырабатывает такие молекулы, почему же он сам не справляется с раком?
Потому что количество этого белка в организме минимально. Его недостаточно для достижения терапевтического эффекта. Также невозможно просто забрать эти молекулы из здоровых клеток, чтобы ввести в больные. Поэтому была разработана особая биотехнология по синтезированию белка в количестве, необходимом для создания препарата. Мы выделили ген человеческой клетки, который отвечает за производство белка, и клонировали его. Затем создали штамм-продуцент и заставили бактериальную клетку синтезировать человеческий белок. Такие клетки хорошо размножаются, что позволило нам получить неограниченное количество белка.
- Ваше изобретение состоит в создании технологии получения «Белка теплового шока»?
Не только. Мы также смогли изучить его структуру, расшифровать механизм противоопухолевого действия на молекулярном уровне. ФМБА обладает уникальной возможностью проводить медицинские исследования с помощью космических программ. Дело в том, что для рентгеноструктурного анализа действия белка необходимо сформировать из него сверхчистый кристалл. Однако в условиях земного притяжения получить его невозможно — белковые кристаллы растут неравномерно. Родилась идея вырастить кристаллы в космосе. Такой эксперимент был проведен в 2015 году. Мы упаковали сверхчистый белок в капиллярные трубочки и отправили их на МКС. За шесть месяцев полета в трубочках сформировались идеальные кристаллы. Они были спущены на землю и проанализированы в России и Японии (там есть сверхмощное оборудование для рентгеноструктурного анализа).
- А эффективность препарата уже доказана?
Мы провели опыты на мышах и крысах, у которых развивались меланомыи саркомы. Курсовое введение препарата в большинстве случаев приводило к полному излечению даже на поздних стадиях. То есть уже можно с уверенностью сказать, что белок обладает необходимой для лечения рака биологической активностью.
Почему вы думаете, что «Белок теплового шока» поможет не только при саркоме, но и при других видах злокачественных образований?
В основе нового препарата — молекула, которая синтезируется всеми видами клеток. Никакой специфичности у нее нет. На другие виды опухолей препарат будет действовать благодаря этой универсальности.
- Нужно ли будет для создания препарата каждый раз отправлять белок в космос?
Нет. Создание кристалла в невесомости требовалось только для научного этапа разработки препарата. Космический эксперимент лишь подтвердил, что мы на правильном пути. А производство будет исключительно земным. Собственно, мы уже изготавливаем препарат на производственных участках НИИ. Он представляет собой раствор белка, который можно вводить пациентам. Мышам мы вводим его внутривенно. Но, возможно, во время клинических испытаний найдем более эффективные подходы — например, оптимальной может оказаться адресная доставка белка в опухоль.
- Есть ли побочные эффекты у нового препарата?
Пока никаких проблем не выявлено. Во время тестирования «Белок теплового шока» не проявил токсичности. Но окончательно мы сможем сделать вывод о полной безопасности препарата только после завершения доклинических исследований. На это потребуется еще год.
- И потом вы сможете начать клинические испытания?
Это целиком зависит от того, удастся ли нам найти источник их финансирования. На доклинический этап мы получили грант от Министерства образования и науки. Клинические исследования стоят очень дорого — около 100 млн рублей. Обычно они проводятся на условиях софинансирования: находится частный инвестор, который вкладывает средства, а государство возвращает 50% в случае успешного завершения. Мы рассчитываем на поддержку Минпромторга или Минздрава.
- А частный инвестор уже найден?
Нет. Нам предстоит большая работа с его поисками. Можно было бы предложить японцам выступить инвесторами, но хочется начать с России, так как это отечественная разработка. Будем стучаться во все двери, потому что препарат уникальный. Мы стоим на пороге открытия совершенно нового средства лечения рака. Оно позволит помочь людям с неизлечимыми опухолями.
- Ведутся ли подобные разработки за рубежом?
Мы слышали о попытках получить препарат «Белка теплового шока» в разных странах. Такие работы ведутся, например, в США, Японии. Но пока никто не опубликовал их результаты. Я надеюсь, что сейчас мы опережаем в этом вопросе зарубежных коллег. Главное — не остановиться на этом пути. А это может случиться только по одной причине — из-за нехватки финансирования.
- Когда реально, при всех благоприятных обстоятельствах, человечество сможет получить лекарство от рака?
Полные клинические испытания обычно проходят два-три года. К сожалению, быстрее не получится — это серьезное исследование. То есть с учетом финальной стадии доклинических исследований пациенты получат новое лекарство через три-четыре года.
10.11.2018
Структурно-функциональные изменения под действием высоких температур.
Высокотемпературное воздействие сказывается прежде всего на текучести мембран, в результате чего происходит увеличение их проницаемости и выделение из клетки водорастворимых веществ. Вследствие этого наблюдается дезорганизация многих функций клеток, в частности их деления. Так, если при температуре 20 °C все клетки проходят процесс митотического деления, при 38 °C - каждая седьмая, а при 42 °C - лишь каждая пятисотая клетка.
Повышенная текучесть мембранных липидов, обусловленная изменением состава и структуры мембраны при перегреве, приводит к потере активности мембранно-связанных ферментов и нарушению деятельности ЭТЦ. Из основных энергопродуцирующих процессов - фотосинтеза и дыхания, наиболее чувствительна ЭТЦ фотосинтеза, особенно фотосистема II (ФС II). Что касается ферментов фотосинтеза, то основной фермент С3-цикла фотосинтеза - РБФ-карбоксилаза - достаточно устойчив к перегреву.
Перегрев оказывает заметный эффект на водный режим растения, быстро и значительно повышая интенсивность транспирации. В результате у растения возникает водный дефицит. Сочетание засухи с жарой и высокой солнечной инсоляцией оказывает максимальное отрицательное влияние на посевы, нарушая, наряду с фотосинтезом, дыханием и водным режимом, поглощение элементов минерального питания.
Молекулярные аспекты повреждений при тепловом шоке. Жара повреждает в клетке прежде всего белки, особенно ферменты, нарушая процесс биосинтеза белков de novo, ингибируя активность ферментов, индуцируя деградацию существующих белков. В результате могут исчезать пулы ферментов, значимых для функционирования клеток как в период стресса, так и последующей репарации. Большинство ключевых ферментов растений термолабильны, включая РБФК, каталазу и СОД. Ингибирование РБФК представляет собой главную причину снижения ИФ при высокой температуре. Жара подавляет также способность превращать сахарозу в крахмал у ячменя, пшеницы и картофеля, указывая на то, что один или несколько ферментов в цепи превращения сильно ингибируются жарой. Непосредственное влияние жары на активность растворимой крахмалсинтазы в эндосперме пшеницы, как in vitro, так и in vivo вызывает подавление накопления крахмала.
Высокие температуры ингибировали активность каталазы у нескольких видов растений, в то время как активность других антиоксидантных ферментов не подавлялась. У ржи изменения активности каталазы были обратимыми и не оставляли видимых повреждений после прекращения жары, в то время как у огурца восстановление активности каталазы замедлялось (тормозилось) и сопровождалось обесцвечиванием хлорофилла, указывающим на более существенное окислительное повреждение. В проростках кукурузы, выращиваемой при повышенных температурах (35 °C), активность СОД была ниже, чем при относительно низких температурах (10 °C).
Жара нарушала целостность мембран, что приводило к повышенной их проницаемости для ионов и растворов. Одновременно нарушалась деятельность ассоциированных с мембранами ферментов фотосинтеза, дыхания и транспорта ассимилятов. Жара повышала степень насыщения жирных кислот мембранных фосфолипидов ЭПР. В условиях сильной жары его мембраны избирательно повреждались, вызывая деградацию мРНК (3-амилазы. Одновременно индуцированная жарой утечка веществ через мембраны влияет на редокс-потенциал основных клеточных компартментов, что, в свою очередь, нарушает ход метаболических процессов вплоть до гибели клеток.
Окислительный стресс был недавно признан одним из самых главных отрицательных факторов действия жары на растения. Жара вызывает дисбаланс между количеством поглощенной пигментами солнечной радиации и транспортом электронов через цитохромы - процесс, названный фотоингибированием. Избыточная энергия может перейти на кислород, что приводит к образованию АФК. Основными зонами окислительного повреждения в клетках являются митохондрии и хлоропласты, где происходит нарушение транспорта электронов. В хлоропластах высокотемпературный стресс вызывает фотоингибирование фотосинтеза и инактивацию каталазы, что приводит к накоплению АФК и обесцвечиванию хлорофилла. Фотосистема II признана самой чувствительной к действию жары, приводящей к дезинтеграции функциональных компонентов комплекса ФС II и, соответственно, нарушению транспорта электронов между ФС I и ФС II, увеличению потока электронов на молекулярный кислород и образованию АФК. В результате снижается ИФ, что представляет собой основную причину потери урожая при действии жары.
Белки теплового шока. Синтез белков теплового шока (БТШ) в ответ на увеличение температуры был обнаружен в 1974 г. Он характерен для всех типов живых организмов, включая высшие и низшие растения. БТШ у всех организмов представлен большим набором полипептидов, которые принято именовать в соответствии с молекулярной массой, выраженной в килодальтонах (кДа). Например, БТШ с молекулярной массой 70 кДа называют БТШ 70. О существенной роли БТШ в жизни клеток говорит высокая консервативность их эволюции. Так, отдельные участки в эволюции БТШ 70 сохраняют свыше 90% гомологии у бактерий и человека. БТШ растений представлены группой высокомолекулярных (110-60 кДа) и низкомолекулярных (35-15 кДа) белков. Отличительными чертами растений являются множественность низкомолекулярных БТШ и высокая интенсивность их синтеза при тепловом шоке (ТШ).
Синтез БТШ - стрессовая программа, включаемая тепловым шоком, происходит при подъеме температуры на 8-10 °C выше нормальной. Так, в листьях ячменя максимум синтеза БТШ достигается при 40 °C, а в листьях риса - при 45 °C. Переключение нормальной жизни клетки на стрессовую программу включает в себя репрограммирование генома, связанное с торможением экспрессии генов, активность которых характерна для жизни в нормальных условиях, и активацией генов ТШ. В клетках растений мРНК, кодирующие БТШ, обнаруживаются через 5 мин после начала стресса. Кроме того, происходит распад полисом, синтезирующих белки, типичные для нормальных условий, и формирование полисом, синтезирующих БТШ. Быстрое включение синтеза БТШ на уровне не только транскрипции (синтез РНК на ДНК), но и трансляции (синтез белка на мРНК) достигается в результате координации многих событий. Тепловой шок вызывает изменения в мРНК, синтезированных в клетке до шока, связанные с модификацией белковых факторов трансляции и рибосомных белков. Кроме того, мРНК БТШ имеют отличия от мРНК обычных белков. В результате ТШ происходит ослабление, а затем и прекращение синтеза обычных белков и переключение аппарата белкового синтеза на синтез БТШ, которые обнаруживаются в клетке уже через 15 мин после начала ТШ. Максимум синтеза наблюдается через 2-4 ч, затем идет его снижение.
Синтез различных БТШ происходит при разной температуре. В хлоропластах синтез высокомолекулярных БТШ активировался в диапазоне 34-42 °C, ослабевал при 44 °C и резко снижался при 46 °C. Индукция синтеза низкомолекулярных БТШ была особенно заметной при 40-42 °C. Существенное угнетение синтеза РБФК происходило только при температуре выше 44 °C. Почти все из обнаруженных БТШ хлоропластов кодируются в ядре, синтезируются в цитоплазме, а затем транспортируются в хлоропласт, где и выполняют защитную функцию во время ТШ. После окончания теплового шока синтез БТШ прекращается и возобновляется синтез белков, характерных для клетки в нормальных температурных условиях. При этом мРНК БТШ быстро разрушаются в клетках при нормальной температуре, тогда как сами белки могут сохраняться существенно дольше, обеспечивая, по-видимому, повышение устойчивости клеток к нагреванию. Длительное пребывание клеток в условиях ТШ обычно также приводит к ослаблению и прекращению синтеза БТШ. В этом случае включаются механизмы регуляции экспрессии генов БТШ по принципу обратной связи. Накопление в клетках БТШ снижает активность их генов. Возможно, таким путем клетка поддерживает количество БТШ на необходимом уровне, препятствуя их сверхпродукции.
Как правило, в ответ на повышение температуры синтезируются соответствующие белки, что способствует повышению термоустойчивости организма. Защитная роль БТШ описывается моделью молекулярного шаперона (в пер. с англ. - провожатый, наставник при молодой особе). В экстремальных условиях БТШ «опекают» функционирование конкретных макромолекул, клеточных структур, освобождают клетки от поврежденных компонентов, что позволяет поддерживать клеточный гомеостаз. Взаимодействие БТШ 70 с другими белками зависит от соотношения АТФ/АДФ. Считается, что БТШ 70 в комплексе с АДФ удерживает на себе расплетенный белок, а замена АДФ на АТФ приводит к освобождению этого белка из комплекса с БТШ 70.
В соответствии с этой моделью БТШ повышают термоустойчивость клеток, обеспечивая следующие процессы: энергозависимую стабилизацию нативной структуры белков; правильную сборку олигомерных структур в условиях гипертермии; транспорт веществ через мембраны органелл; дезагрегацию неправильно собранных макромолекулярных комплексов; освобождение клетки от денатурированных макромолекул и реутилизацию входивших в них мономеров с помощью убиквитинов. Убиквитины - низкомолекулярные белки теплового шока, присоединение которых к полипептиду делает его мишенью протеаз. Это своего рода «метка смерти» для белков. При их помощи происходит выбраковка и удаление поврежденных и недостроенных в результате действия ТШ белков.
В пользу защитной функции БТШ при ТШ свидетельствует целый ряд фактов. В частности, показано, что выключение синтеза белка специфическими ингибиторами во время ТШ, когда происходит синтез БТШ, приводит к гибели клеток. Клетки можно закаливать, повышая их термоустойчивость путем предварительного кратковременного воздействия повышенных температур. Условия такой закалки совпадают с условиями индукции синтеза БТШ. Интересно, что синтез БТШ у растений индуцирует не только ТШ, но и, например, соли кадмия и арсенит, обработка которыми повышает устойчивость клеток к нагреву. Важно также подчеркнуть, что изменения в структуре гена (мутации), нарушающие синтез БТШ, приводят к потере устойчивости клеток к нагреву. Дальнейшие исследования конкретной функции каждого БТШ при стрессе позволят выяснить молекулярные механизмы формирования и функционирования защитных свойств при ТШ.
Большинство белков ТШ имеют в клетках родственные белки, которые синтезируются при нормальной температуре постоянно или в определенные фазы онтогенеза. Оказывается, эти белки, в частности БТШ 70, присоединяются к другим белкам, вызывая их разворачивание и препятствуя их агрегации. Последнее может помешать белку приобрести нативную конформацию, необходимую для его функциональной активности. Разворачивание белков с помощью БТШ необходимо для их проникновения через мембрану хлоропластов, митохондрий и ЭПР. Поскольку агрегация белков при повышении температуры резко усиливается, активация синтеза БТШ 70 в этих условиях должна защищать белки от необратимого повреждения. БТШ присутствуют во всех компартмен-тах клетки, в частности ядре и ядрышках, где они накапливаются при ТШ. БТШ 70 способствует прохождению синтезируемых в цитоплазме предшественников хлоропластных и митохондриальных белков через мембрану, играя роль в биогенезе этих органелл. БТШ 60, тоже относящиеся к шаперонам, называют также шаперонинами. Эти белки обеспечивают правильную сборку четвертичной структуры клеточных белков, например ключевого фермента фотосинтеза РБФК, состоящего из восьми больших и восьми малых субъединиц. К группе шаперонов относят также БТШ 90, играющий важную роль в образовании комплекса стероидных гормонов с их рецепторами. Кроме того, БТШ 90 образует комплексы с некоторыми протеинкиназами, контролируя их активность. Как известно, протеинкиназы фосфорилируют самые разные клеточные белки, регулируя их активность.
У растений найдено более 30 низкомолекулярных (15-35 кДа) БТШ, локализованных главным образом в цитоплазматических гранулах теплового шока, появляющихся во время ТШ и исчезающих после него. Их основная функция - защищать «дошоковые» мРНК, что позволяет использовать последние для синтеза белка после окончания шока. Низкомолекулярные БТШ обнаруживаются и в других компартментах, в частности в хлоропластах. Считается, что они защищают от ТШ тилакоидные мембраны, где локализованы процессы световой фазы фотосинтеза.
У некоторых растений обнаружен конститутивный (неиндуцированный) синтез БТШ при формировании, в частности, пыльцы. Возможно, что дошоковые БТШ обеспечивают ее термостабильность при ТШ. Кроме БТШ, жара индуцирует экспрессию белков других классов, в частности кальмодулина.
Метаболизм в условиях теплового шока. Целенаправленных исследований метаболизма растений при действии ТШ крайне мало, причем в этих опытах зачастую одновременно действовали как ТШ, так и засуха. Это очень важный момент, поскольку реакция растений на сочетание засухи и ТШ иная, чем реакция на отдельные стрессоры. Так, при сочетании стрессов растения накапливали несколько растворимых сахаров, в том числе сахарозу, мальтозу, трекаллозу, фруктозу и глюкозу. При действии засухи накапливается пролин, а при действии ТШ, а также сочетания ТШ и засухи пролин в растениях не накапливался. В условиях ТШ пролин или его интермедиат (пирролин-5-карбоксилат) токсичны, поэтому пролин не подходит в качестве совместимого осмолита. При одновременном действии ТШ и засухи резко возрастает содержание глутамина. Видимо, при ингибировании биосинтеза пролина, глутамат трансформируется в глутамин. Одновременно активируются гены, кодирующие расщепление крахмала и биосинтез липидов, а также повышается экспрессия генов, кодирующих гексокиназу, глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназу, фруктокиназу и сахарозо-УДФ-глюкозилтрансферазу. Именно изменения в экспрессии генов на уровне транскрипции представляют главный фактор перепрограммирования углеводного метаболизма.
При действии ТШ на проростки арабидопсиса установлено синхронное повышение размера пулов целого ряда аминокислот и амидов (аспарагина, лейцина, изолейцина, треонина, аланина и валина), получаемых из ЩУК и ПВК. Кроме того, увеличилось содержание углеводов: мальтозы, сахарозы, галактинола, миоинозитола, раффинозы и моносахаридов, предшественников клеточной стенки. Уже через 6 ч увеличивались концентрации b-аланина, глицерина, мальтозы, сахарозы, трекаллозы.
Фотосинтез, транспирация и дыхание. Показателем, тесно связанным с регуляцией CO2- и Н2O-обмена растений, является устьичная проводимость. Многочисленные данные свидетельствуют о том, что высокие температуры индуцируют закрывание устьиц, которое можно рассматривать как косвенную реакцию на температурную зависимость дефицита давления водяных паров и дыхания листьев. Так, частичное закрывание устьиц является следствием повышения внутриклеточной концентрации CO2. Однако искомое закрывание устьиц не приводит к снижению фотосинтеза, поскольку температурные зависимости устьичной проводимости и ИФ не совпадают. Так, устьичная проводимость повышается при таких температурах, когда фотосинтез необратимо ингибируется.
Хотя устьичная проводимость, видимо, прямо не влияет на ИФ, она помогает регулировать транспирацию, которая благодаря контролю за температурой листа воздействует на жароустойчивость процесса фотосинтеза. В посевах некоторых культур при достаточном влагообеспечении температура воздуха благодаря терморегуляции может быть почти на 8 °C ниже температуры воздуха над посевом. Вместе с тем при дефиците влаги в почве может наблюдаться обратная картина - температура листьев в посеве превышает температуру окружающего воздуха почти на 15 °C, что усиливает негативное воздействие водного дефицита на ИФ.
Интенсивность нетто-фотосинтеза пшеницы и большинства С3-культур достаточно стабильна в диапазоне 15-30 °C. Ниже и выше данного температурного диапазона ИФ снижается на 5-10% на каждый градус (рис. 3.1). Относительно незначительное изменение нетто-фотосинтеза в диапазоне 15-30 °C не должно скрывать тот факт, что гросс-фотосинтез с повышением температуры в действительности повышается. Однако из-за одновременного повышения ИД всего растения и особенно фотодыхания интенсивность нетто-фотосинтеза изменяется мало.
Между C3- и С4-культурами в этом отношении существуют заметные различия, причем оптимальная интенсивность нетто-фотосинтеза у С4-видов наблюдается при более высоких температурах (30-40 °C). Фотодыхание у них незначительное, в результате чего повышение фиксации CO2 с увеличением температуры не маскируется фотодыхательными затратами. Действительно, более высокий температурный оптимум нетто-фотосинтеза у С4-видов в сравнении с С3-видами объясняется меньшими дыхательными затратами при повышенных температурах у первых. Необратимые изменения фотосинтетического аппарата у них отмечаются лишь при превышении температуры 40 °C главным образом из-за повреждения ФС II, наступающего в течение нескольких минут после начала действия ТШ, что оказывает решающее влияние на урожайность.
«Белками теплового шока» (сокр. БТШ или HSP от англ. Heat shock proteins) называются особые соединения, которые клетки живых организмов продуцируют при резком повышении температуры или в результате других стрессовых нагрузок. Первые HSP впервые были обнаружены учеными еще в середине прошлого века. С тех пор роль белков теплового шока в организме растений, животных и человека активно изучалась.
Вначале считалось, что они выполняют исключительно защитную роль, предупреждая возникновение необратимых нарушений. Однако со временем выяснилось, что эти соединения могут принимать активное участие в регенерации поврежденных структур клетки, а также в работе иммунной системы.
В том числе, была выдвинута гипотеза, что HSP участвуют в связывании белковых фрагментов, появляющихся при разрушении клеток злокачественных опухолей. При этом образуются конгломераты, распознаваемые противораковым иммунитетом в качестве «агрессора», т.е. происходит так называемая «презентация антигена». Другими словами, иммунная система человека получает возможность «видеть рак», который в обычных условиях может достаточно успешно от нее маскироваться. В результате запускается естественный процесс уничтожения опухоли.
Подтверждение этой теории, а также доскональное изучение структуры белка теплового шока и его действия в опухолевых тканях на молекулярном уровне, стало возможным только после того, как это уникальное вещество попало на международную космическую станцию. Отправили его в космос российские специалисты НИИ Особо Чистых Биопрепаратов ФМБА, синтезировавшие БТШ с помощью эксклюзивных технологий генной инженерии.
Благодаря невесомости, из исходного материала, «упакованного» в тончайшие молекулярные трубочки, выросли идеально ровные кристаллы белка, пригодные для рентгеноструктурного анализа. Космический этап позволил успешно решить главную проблему, стоявшую перед учеными: в условиях земного притяжения белки росли неравномерно, и получить кристаллы с правильной геометрией на Земле было невозможно. Анализ выращенных в космосе кристаллических белков был проведен российскими и японскими учеными на современном сверхмощном оборудовании.
Полученные данные легли в основу создания уникального препарата, действие которого опробовали сначала в пробирках на клеточных культурах, а потом – на лабораторных животных. Лекарством на основе синтезированного БТШ были пролечены мыши с саркомой и меланомой, включая животных с четвертой (терминальной) стадией заболеваний.
Результаты оказались более чем впечатляющими:
- абсолютное большинство мышей полностью выздоровело;
- не было зарегистрировано ни одного побочного эффекта.
Как российские ученые получают белок теплового шока
HSP продуцируется клетками бактерий, в которые внедрен выделенный из клеток человека и клонированный ген. Этот ген отвечает за синтез белка теплового шока. В настоящее время его изготовление по данной технологии ведется на производственных участках НИИ ОЧБ.
Как «работает» лекарство, и какие виды рака можно будет лечить с его помощью
Применение биопрепарата направлено на повышение концентрации БТШ в опухолевых тканях онкобольных до значений, вызывающих терапевтический эффект. Такая потребность существует потому, что «показывающий рак иммунитету» белок теплового шока в организме человека:
- вырабатывается в очень небольших количествах;
- не может быть «собран» в здоровых клетках и «перенесен» в атипичные клетки раковой опухоли.
Разработчики утверждают, что разработанный ими метод универсален так же, как универсален сам белок, продуцируемый всеми тканями нашего организма. Поэтому если при дальнейших испытаниях лечебное действие лекарства подтвердится, а побочные не будут выявлены, его можно будет применять для терапии абсолютно всех форм рака.
Другие достоинства российской разработки:
- Лечение эффективно на терминальных стадиях, т.е. именно тогда, когда справится с опухолью каким-либо другим способом чрезвычайно сложно, очень часто – невозможно.
- Ученые рассматривают возможность целенаправленного действия препарата. До настоящего времени лекарство вводилось лабораторным животным внутривенно и распространялось с кровью по всему организму. На этапе клинических испытаний специалисты планируют параллельно с внутривенным введением опробовать методику адресной доставки белка теплового шока в клетки опухоли, рассчитывая еще более увеличить эффективность лечения и снизить риск побочных эффектов. Эта возможность принципиально отличает российскую технологию от метода «клеточной терапии CAR-T» , официальное внедрение которого в клиническую практику ожидается уже летом 2017 года.
Деньги на заключительный этап доклинических исследований нового средства (порядка 100 млн. рублей) уже найдены. Остается найти спонсора, который разделит с государством финансирование клинических испытаний. Пока приоритеты отдаются российскому бизнесу. Если же российских спонсоров найти не удастся, будут рассматриваться варианты партнерства с японскими предпринимателями или бизнес-структурами из других стран. На завершение процесса испытаний может понадобиться еще 3-4 года. При их положительном исходе онкологи смогут получить высокоэффективный инструмент в борьбе с раком.
Что может сдерживать инвесторов и снижать уровень оптимизма при прогнозах
Вложения в любые клинические испытания несут достаточно большие риски для бизнеса. Ведь даже при современном развитии науки нельзя со стопроцентной вероятностью предположить, как поведет себя новое лекарство, насколько эффективным и безопасным оно окажется не в пробирке и в организме лабораторной мыши, а на практике. Тем не менее, поиски инвестиций – всего лишь вопрос времени.
Насколько действенным будет новый метод, также покажет время. Например, нельзя исключить, что при ослабленном естественном иммунитете его возможностей для борьбы с опухолью может просто не хватить.
И, разумеется, только по истечении нескольких лет можно будет понять:
- смогут ли раковые клетки мутировать в поисках защиты от «ударных доз» БТШ;
- не вызовет ли действие препарата нежелательных последствий в отдаленном периоде.