Что такое инактивация ферментов. Экспоненциальный закон надежности в кинетике инактивации ферментов. Подавление экзокринной функции железы

Релаксационные методы основаны на том принципе, что при быстром внешнем воздействии на систему (изменение температуры, давления, пр.) время, которое нужно системе для достижения нового равновесия (или стационарного состояния), зависит от скорости химической реакции (и иногда от скорости диффузии реагентов.

Рассмотрим простейшую реакцию комплексообразования активного центра фермента с лигандом

В начале система находится в равновесии, которое характеризуется константой равновесия K 0 =K (T 0) и соответственно равновесными концентрациями,,
. Предположим, что в системе резко меняется температураT ->T 0 +T . Это приводит к изменению константы равновесияK ->K 0 +K , которое определяется отношением

(2.50)

где H – стандартное изменение энтальпии. После этого система переходит в новое равновесное состояние:

(2.51)

(2.52)

Уравнение (2.51) нелинейно. Предположим, что отклонение от равновесия невелико и тогда

и уравнение (2.51) преобразуется в линейное дифференциальное уравнение:

Решение этого дифференциального уравнения:

Величина

(2.54)

называется временем релаксации.

2.5. Влияние температуры и pH на скорость ферментативных реакций

Влияние этих факторов на скорость элементарной химической реакции было рассмотрено в Гл.1. Особенность состоит в том, что ферментативные реакции являются сложными многостадийными реакциями (состоящие из многих элементарных реакций). Кроме того, состояние молекул фермента в растворе характеризуется набором конформеров, обратимо переходящих друг в друга. Конформационные переходы молекулы определяются в значительной степени температурой и pHраствора.

2.6. Ингибирование ферментативных реакций

Вещества, подавляющие каталитическую активность ферментов, называются ингибиторами . Различают два основных класса ингибиторов –обратимые

(2.55)

(пестициды, зарин, зоман, аспирин и др.)

и необратимые (инактиваторы )

(2.55)

(окись углерода, цианид-ион, анальгин и др.)

2.7. Инактивация ферментов

Биополимерные молекулы (ферменты) являются термодинамически неустойчивыми и, как правило, с течением времени изменяют свою структуру и свойства. В большинстве случаев процесс инактивации может быть описан как переход между двуми состояниями фермента активного E a и неактивногоE i :

(2.56) Кинетика процесса описывается соответствующим дифференциальным уравнением

(2.57)

и характеризуется постоянной времени

(2.58)

Процесс инактивации фермента может иметь различную физико-химическую природу. Наиболее общим является тепловая денатурация, представляющая собой существенную перестройку макромолекулы, изменение третичной и частично вторичной структуры.

Для целей инактивации могут быть использованы кавитационный ультразвук, радиоактивное излучение и пр.

Изменение pHтакже может привести к денатурации фермента. При каждом значенииpHбелок характеризуется соответствующим распределением зарядов (ионогенные группы). При очень низких или очень высокихpHраспределение зарядов может существенно поляризовать молекулу, приводить к появлению изомеров и необратимо конформировать ее с разрушением структуры активного центра. Например:

Денатурацию фермента вызывают и денатурирующие агенты , разрушающие вторичную структуру белка (например, мочевина), а также окислительные процессы с участием кислорода.

При изучении таких процессов важная информация получена релаксационными методами. Как правило, конформационные изменения сопровождаются изменением окружения ароматических аминокислот – тирозина и триптофана (полоса поглощения излучения на 290 нм). Это проявляется в изменении спектров поглощения и флуоресценции.

Обратимые конформационные изменения обычно идут со временем 0.1-100 мс, а необратимые – 1-1000 мин.

Пример 1. Простейшая кинетическая схема инактивации с равновесием конформеров:

(2.59)

Кинетика процесса описывается одним характеристическим временем

(2.60)

Пример 2. Инактивации подвержены оба конформера:

(2.61)

(2.62)

Пример 3. Более общий случай для системы с участиемn конформеров:

Часто ферменты в растворе образуют димеры, и в димерной форме оказываются стабильнее. Тогда наблюдается диссоциативный механизм инактивации :

(2.65)

Следующая схема отражает возможные механизмы инактивации в процессе реакции (мономолекулярная инактивация свободной формы фермента, мономолекулярная инактивация фермен-субстратного комплекса, бимолекулярная инактивация фермента субстратом, бимолекулярная инактивация фермента продуктом):

(2.66)

Дискриминация механизмов инактивации и определение кинетических характеристик реакции обычно проводится несколькими методами:

анализируя зависимость выхода продукта от концентрации фермента;

устанавливая связь степени конверсии субстрата со степенью инактивированности фермента;

проведение реакции при низких степенях конверсии субстрата и низких концентрациях фермента;

проведение реакции при больших концентрациях фермента;

предынкубация фермента с компонентами реакции;

использование интегральных уравнений реакции.

Преподаватель:
к.б.н
Кузнецова Екатерина Игоревна

Механизмы инактивации ферментов
1. Изменение первичной структуры:
1.1. Разрыв полипептидной цепи:
Жесткие условия (длительное кипячение в HCl) –
гидролиз до отдельных ам-т.
При нагревании до 100 °С (pH 7-8), гидролиз
пептидных связей незначителен.
Наиболее чувствительными к
высокотемпературному гидролизу являются
пептидные связи, образованные остатками
аспарагиновой кислоты.
Протеазы (бактериальное загрязнение, автолиз).

Решение:


инактивированных ферментов.

1.2.Окисление функциональных групп фермента
SH-группы цистеина и индольные фрагменты
триптофана, при повышенной температуре, могут
окисляться (сульфокси- соединения цистеина
(SOH, SO2H) и образовываться продукты
раскрытия индольного кольца триптофана.

Решение:
Реактивировать с помощью восстанавливающих
агентов, в частности низкомолекулярных тиолов
(например, цистеин или дитиотрейтол) .

Вызывают: Тиолы и другие восстановленные
соединений серы, например Na2SO3, Na2S2O3.
Продуктом восстановления дисульфидной связи
(S-S) является:
1) тиольная форма (белок–SH)
2) смешанный дисульфид тиольной формы белка с
восстанавливающим реагентом, например
белок–S–SO3).

1.3. Расщепление дисульфидных связей
Щелочной гидролиз цистеина →дегидроаланин→
Благодаря нуклеофильным свойствам
взаимодействует с NH2-группами лизина и SHцистеина →лизиноаланин и лантионин.
Для полной деструкции всех S–S связей требуются достаточно жесткие условия (0,1–1М щелочь,
100 °С).
Однако деструкция наиболее реакционноспособных
S–S связей может проходить в достаточно мягких
условиях – например, при температурах 60–80 °С и
слабощелочных значениях рН.
Cледует учитывать при использовании ферментов в
качестве добавок к моющим средствам.

Решение:
Добавление в среду тиолов приведет к
расщеплению смешанного дисульфида и
последующему образованию правильной S–S связи

1.4. Химическая модификация каталитических SHгрупп.
Катионы тяжелых металлов (Hg, Pb и Cu)
связываются с SH-групп активного центра
фермента
↓
Образование соответствующих меркаптидов
↓
Фермент инактивируется

10.

1.5. Фосфорилирование белков in vivo.
Под действием фосфорилазы и фосфатазы,
содержащихся в полуочищенных ферментативных
препаратах в виде примесей
↓
Фосфорная кислота связывается с ОН-группами
серина и треонина.
↓
Конформационные изменения в белковой
молекуле
↓
инактивацию фермента.

11.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

12.

1.6. Дезаминирование остатков аспарагина.
При температурах (порядка 100 °С) и рН (порядка
4,0–5,0) происходит дезаминирование остатков
аспарагина.
↓
инактивации фермента.

13.

Решение:
В литературе практически отсутствуют примеры
удачной реактивации подобным образом
инактивированных ферментов.

14.

1.7. Радиационная инактивация ферментов
γ-облучение и УФ-свет
Воздействуют на функциональные группы
ферментов, пептидные связи и SH-группы
остатков цистеина.

15.

2. Агрегация
Наблюдается при повышенной температуре, при
экстремальных значениях рН, в присутствии
некоторых химических соединений.
Чем выше концентрация, тем быстрее идет
агрегация.
Гидрофобные взаимодействия и водородные
связи, возможно образование дисульфидных
мостиков между отдельными белковыми
молекулами

16.

Решение:
Необходимо разрушить межмолекулярные
ковалентные и нековалентные контакты c
помощью концентрированных растворов
мочевины и гуанидинхлорида, экстремальных
значений рН.
Если при агрегации ферментов образовались
межмолекулярные S-S -мостики, в среду вносят в
относительно невысоких концентрациях
(мкмоль/л) тиолсодержащие реагенты (например,
цистеин или дитиотрейтол).
При таких концентрациях внутримолекулярные
S–S связи в белке, как правило, не затрагиваются.

17.

3. Инактивация ферментов поверхностным
натяжением
Поверхностное натяжение на границе раздела
между воздухом и чистой водой составляет 80
дин/см.
Пенообразование вызывает денатурацию
ферментов, адсорбированных на границе раздела
фаз.

18.

Решение:
Добавление ПАВ снижает поверхностное
натяжение до 1 дин/см.

19.

4. Сорбция белка на стенках реакционного
сосуда
Сорбция за счет нековалентных взаимодействий
приводит к уменьшению концентрации фермента в
растворе.
Необходимо учитывать при работе с
разбавленными белковыми растворами
(концентрация 10-8–10-10 моль/л).
Под влиянием денатурирующих факторов
способность белков сорбироваться на стенках
реакционного сосуда может возрастать.

20.

Решение:
Десорбция фермента со стенок реакционного
сосуда достигается за счет разрушения
неспецифических взаимодействий между
белком и сорбционными центрами на поверхности
сосуда.
Можно использовать экстремальные значения рН,
концентрированные растворы мочевины или
гуанидинхлорида.

21.

5. Диссоциация олигомерных белков на
субъединицы
Вызывают: Мочевина, детергенты, кислоты или же
нагревание.
Приводят к:
конформационным изменениям отдельных
субъединиц;
агрегации субъединиц;
диссоциации кофакторов из активных центров;
модификации функциональных групп, которые в
олигомерном белке были экранированы от
контакта с растворителем.

22.

6. Десорбция кофактора из активного центра
фермента
Вызывает: нагревание, действие хелаторов, диализ
Если диссоциация кофактора сопровождается
значительными конформационными сдвигами или
химической модификацией важных
функциональных групп → фермент
инактивируется необратимо.
Если при этом не произошло существенного
изменения белковой конформации, то добавление
в среду избытка кофактора приводит к
реактивации фермента.

23.

Регенерация кофакторов
Способы регенерации:
Ферментативный (методы с использованием сопряженных субстратов или ферментов)
Неферментативный (химические и
электрохимические подходы)

24.

Ферментативный способ

В систему вводят избыточное количество
сопряженного субстрата того же фермента:
Пример: при работе алкогольдегидрогеназы
расходуется НАДН.

25.

Ферментативный способ
1. Использование сопряженных субстратов.
Недостатка:
используются высокие концентрации
сопряженного субстрата, так как равновесие
реакции сильно сдвинуто в сторону
образования спирта;
усложняет процедуру выделения основного
продукта из реакционной смеси.

26.

Ферментативный способ
2. Использование сопряженных
ферментативных реакций
В систему, дополнительно вводят фермент 2,
функционирование которого обеспечивает
регенерацию кофермента.
Используемые в системе ферменты должны иметь
разную субстратную специфичность

27.

Неферментативные способы
1. Химические методы.
Используются дитионит натрия и некоторые
соли пиридиния:
+ Низкая стоимость.
- могут ингибировать отдельные ферменты.
Флавиновые коферменты

28.

Неферментативные способы
2. Электрохимические методы.
Прямое электрохимическое восстановление или
окисление.
“-” появления в процессе регенерации
ферментативно неактивных форм кофермента,
например в результате его димеризации.

29. СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ В БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМАХ

30.

Проблемы возникающие при использовании
ферментов в биотехнологических процессах:
1. Повышенные температуры
2. Экстремальные значения pH
3. Высокие концентрации органических
растворителей или ПАВ.
4. Невозможность многократно использовать
фермент.
5. Сложность при разделении фермента от
продукта.

31.

Основные подходы для стабилизации
ферментов:
1. Добавление стабилизирующих веществ в среду,
в которой хранится фермент или проводится
ферментативная реакция.
2. Химическая модификация фермента.
3. Иммобилизация фермента.

32.

1. Субстратов или их аналогов:
Фермент-субстратный комплекс часто более
устойчив, чем свободный фермент.
Пример: Лактатдегидрогеназа в присутствии
лактата более термоустойчив.

33.

Стабилизация ферментов с помощью:
2. Органических растворителей:
Многоатомные спирты стабилизируют некоторые
ферменты за счет повышения устойчивости
внутримолекулярных водородных связей белка.
Пример: Химотрипсин в присутствии 50–90 %
глицерина более устойчив к протеолизу

34.

Стабилизация ферментов с помощью:
3. Солей:
При низких концентрациях солей (<0,1M) катионы
Са2+, Zn2+, Mn2+,Fe2+ и др. могут специфично
взаимодействовать с металлопротеинами.
Некоторые из них - кофакторы.
Са2+ способен стабилизировать третичную
структуру ряда белков благодаря образованию
ионных связей с двумя различными
аминокислотными остатками.
Пример: у α-Амилазы (из bacillus caldolyticus)
Са2+ значительно повышает термическую
устойчивость.

35.

36.

Химическая модификация фермента
1. Фермент принимает более стабильную
конформацию.
2. Введение в белок новых функциональных групп
приводит к образованию дополнительных
стабилизирующих водородных связей или солевых
мостиков.
3. При использовании неполярных соединений
усиливаются гидрофобные взаимодействия.
4. Модификация гидрофобных областей поверхности
белка гидрофильными соединениями уменьшает
площадь неблагоприятного контакта внешних
неполярных остатков с водой.
Пример: глутаровый альдегид

37.

Иммобилизация фермента позволяет:
Повысить устойчивость фермента (нагреванию,
автолизу, действию агрессивных сред и т. д)
1. Многократно использовать фермент
2. Отделять фермент от реагентов и продуктов
реакции.
3. Прерывать реакцию в нужный момент.

38.

Иммобилизованные ферменты – это препараты
ферментов, молекулы которых связаны с
носителем, сохраняя при этом полностью или
частично свои каталитические свойства.
Методы иммобилизации:
1. Химические
2. Физические

39.

Методы иммобилизации:
В качестве носителей могут применяться:
1)Органические материалы:
1.1) природные (полисахариды, белки, липиды)
1.2) синтетические полимерные носители
2) Неорганические материалы (матрицы на
основе силикагеля, глины, керамики, природных
минералов и т. д.)

40.

1) адсорбция фермента на нерастворимом носителе
в результате электростатических, гидрофобных,
вандер-ваальсовых и др. взаимодействий;

;

структуры;
4) Включение в двухфазную систему.

41.

Методы физической иммобилизации:

Достигается путем контакта водного раствора
фермента с носителем.

42.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Факторы влияющие на адсорбцию:
1. Удельная поверхность и пористость носителя
2. Значение рН (на не ионообменниках мах адсорбция
в изоэлектрической точке белка)
3. Ионная сила раствора (возрастание ионной силы –
десорбция фермента, но иногда обратная ситуация
“высаливание”)
4. Концентрация фермента.
5. Температура (с одной стороны денатурация, с
другой ускоренная диффузия)

43.

Методы физической иммобилизации:
1)адсорбция фермента на нерастворимом носителе
Преимущества:

2) Доступность носителей
Недостатки:
1) Недостаточная прочность связывания
2) Многие носители биодеградируемы

44.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану

45.

Методы физической иммобилизации:
2) включение фермента в полупроницаемую
капсулу, в полупроницаемую мембрану
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Защита от микроорганизмов
3) Нет диффузионных ограничений (т.к.
отношение поверхности к площади велико и
толщина мембраны невелика)
Недостатки:
1) Биодеградируемы
2) Не применим для высокомолекулярных

46.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Фермент включается в трехмерную сетку
полимерных цепей, образующих гель.

47.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Необходимо учитывать:
1. Соответствие размера пор размеру фермента.
2. Природа матрицы (т.к. она создает
микроокружение для фермента, может
создавать рН отличное от рН раствора и
повышать сродство субстрата к матрице, что
повышает скорость ферментативной реакции)

48.

Методы физической иммобилизации:
3) механическое включение фермента в гелевые
структуры
Преимущества:
1) Относительная простота методики
2) Повышенная механическая, химическая и
тепловая стойкость матриц.
3) Происходит стабилизация фермента
4) Фермент защищен от бактериального
повреждения
Недостатки:
1) Не применим для высокомолекулярных

49.

Методы физической иммобилизации:
4) Включение в двухфазную систему
Фермент растворим только в одной из фаз, а
продукт - в другой
Позволяет работать в высокомолекулярными
субстратами.

50.

Методы химической иммобилизации:
Образовании ковалентных связей между
ферментом и носителем.
Преимущества:
1) Высокая прочность конъюгата
2) Можно повышать стабильность фермента

51.

При иммобилизации ферментов необходимо
соблюдать следующие условия:
1. Активные группы матрицы не должны
блокировать каталитический центр фермента.
2. Иммобилизации не должны приводить к потере
активности фермента.

52.

Весьма перспективным является использование в
качестве биокатализаторов иммобилизованных
клеток.
Т.к. можно избежать:
1) дорогостоящие стадии выделения и очистки
ферментов
2) необходимости их последующей стабилизации

53.

Термозимы
Стабильны в условиях высокой температуры,
высоких концентраций солей и экстремальных
значений рН.
Гипертермофильные микроорганизмы,
встречающиеся среди Archaea и Bacteria, живут
при температурах 80–100 °С.

54.

Механизмы ответственны за термоустойчивость
ферментов у термозимов:
Между мезофильными и термофильными
версиями ферментов - высокая степень гомологии
последовательности и структуры.
Так, последовательности термостабильных
дегидрогеназ из Pyrococcus и Thermotoga на 35 и
55% соответственно идентичны
последовательности мезофильной дегидрогеназы
из Clostridium.

55.

Было обнаружено, что дегидрогеназа из Pyrococcus
furiosus (Tm == 105 °C) содержит 35 изолейцинов,
в то время как дегидрогеназы из Thermotoga
maritima (Tm = 95 °C) и Clostridium symbiosum (Tm
= 55 °C) только 21 и 20 изолейцинов
соответственно.
Термостабильные ферменты содержат меньше
глицина: Cs дегидрогеназа содержит 48 остатков
глицина, а дегидрогеназы из Tm и Pf только
39 и 34 глицина соответственно.
Больше изолейцина и меньше глицина.

56.

Возросшая термостабильность коррелирует:
1) с увеличением жесткости белковой структуры
за счет уменьшения содержания остатков
глицина,
2) с улучшением гидрофобных контактов в ядре
дегидрогеназы из Pf в результате замены валина
изолейцином. (В результате сайт-направленного
мутагенеза приводящего к замене изолейцина
на валин термостабильность мутантов
уменьшалась).

57.

Механизмы стабилизации:
минимизация доступной площади гидрофобной
поверхности белка;
оптимизация упаковки атомов белковой
молекулы (минимизация отношения
поверхность/объем);
оптимизация распределения зарядов (достигается
благодаря устранению отталкивающих
взаимодействий, а также в результате организации
взаимодействий между зарядами в своеобразную
сеть)
Уменьшение количества впадин

58.

Применение ферментов из экстремофилов
Современные технологии молекулярной биологии
и генной инженерии позволяет:
1) получать достаточные количества ферментов из
экстремофилов для их последующего
анализа и практического применения.
2)клонирование и экспрессия этих ферментов в
мезофильных организмах.

59.

Крахмал используется для производства сахаров.
Сначала процесс ведется при (95–105 °С) и при значениях
рН 6–6,5.
На следующем этапе температура снижается до 60°С и
рН=4,5.
Использование термостабильных ферментов (αамилазы, глюкоамилазы, ксилозоизомеразы),
выделенных из гипертермофилов, позволит:
1) проводить процесс в одну стадию и при одних и
тех же условиях
2) отказаться от дорогостоящих ионообменников

60.

Применение ферментов из экстремофилов:
Наиболее термостабильные α-амилазы были
обнаружены у archaea Pyrococcus woesei,
Pyrococcus furiosus, Desulfurococcus mucosus,
Pyrodictium abyssi и Staphylothermus
marinus. Гены амилазы из Pyrococcus sp. были
клонированы и экспрессированы в E.coli и Bacillus
subtilis.

61.

Применение ферментов из экстремофилов:
Протеолитические ферменты
Сериновые щелочные протеиназы широко
используются в качестве добавок к моющим
средствам.
Протеиназы из экстремофилов сохраняют
нативность при высоких температурах, в
присутствии высоких концентраций детергентов и
других денатурирующих агентов. Pyrococcus,
Thermococcus, Staphylothermus, Desulfurococcus и
Sulfolobus. Максимальную активность эти
ферменты проявляют при температурах
от 90 до 110 °С и значениях рН от 2 до 10

62.

Применение ферментов из экстремофилов:
ДНК-полимеразы
Термостабильные ДНК-полимеразы используются
в ПЦР и играют важную роль в генной инженерии.
Термостабильные полимеразы были обнаружены у
гипертермофилов Pyrococcus furiosus и Pyrococcus
litoralis, а также у термофилов Thermus aquaticus.

Количество фермента, присутствующего в тканях в любой данный момент времени, определяется относи­тельными скоростями его синтеза и распада, а также кон­центрациями различного рода ингибиторов и активаторов. Как правило, распад ферментов и снижение их количества в среде происходят медленно. Ингибирование и активация ферментов могут осуществляться довольно быстро – в те­чение секунд.

Существует много методов для определения и выражения активности отдельных ферментов. Это обус­ловлено многообразием ферментов, наличием и использованием для определения их активности различных суб­стратов.

Международный биохимический союз предложил сле­дующее определение единицы фермента: «За единицу лю­бого фермента принимается то его количество, которое катализирует превращение одного микромоля субстрата в минуту при заданных стандартных условиях ». Число микромолей и будет равно числу стандартных единиц . Международная комис­сия предложила, если это возможно, проводить опре­деление активности фер­ментов при 30 °С и при оптимальных для фермен­тативной активности зна­чениях рН и концентра­ции субстрата.

Общие свойства фер­ментов вытекают из ихбелковой природы . Ферменты термолабильны, их активность зависит от рН среды и влажности , в которой они действуют, а также от влияния активаторов и ингибиторов .

При повышении температуры до определенных преде­лов активность ферментов усиливается . При достижении оптимальной для фермента температуры его каталитическая активность бывает наиболее высокой. Оптимальная температура для многих ферментов лежит чаще всего в пределах от 40 до 50 °С (оптимальная для растительных ферментов – 50 – 60 °С, а для ферментов животного происхождения – 40 – 50 °С). Однако оптимальная температура не является строго постоянной и зависит от многих при­чин, и в частности от продолжительности нагревания. Чем продолжительнее действие фермента, тем оптимальная температура должна быть ниже .

В интервале температур от 0 до 50 °С при повышении или понижении температуры на каждые 10 °С активность ферментов возрастает или соответственно падает в 1,4 – 2 раза. При дальнейшем нагревании активность ферментов снижается, и при 80 – 100 °С ферменты обычно полностью теряют каталитические свойства в связи с де­натурацией белка .

Температура инактивации (потери активности) у разных ферментов неоди­накова . Так, инактивация фермента амилазы в растворе происходит при 70 °С, сахаразы – при 59, трипсина и пепсина – при 65 °С. В сухом состоянии ферменты могут переносить нагревание до более высоких температур. Но при очень высоких температурах инактивация фер­ментов наступает мгновенно. При пастеризации, стерилизации, бланшировке и кипячении фермен­ты разрушаются .

После тепловой инактивации некоторые ферменты вос­станавливают свою каталитическую активность. Примером может служить пероксидаза, которая даже при нагревании в течение 60 с до 150 °С не полностью теряет каталитические свойства. Поэтому пероксидазу считают самым термостабильным ферментом.

При температурах ниже 0 °С каталитическая деятель­ность ферментов резко снижается, но все же сохраняется даже при замораживании продуктов .

Реакция среды оказывает существенное влияние на ка­талитическую активность ферментов. Ферменты изменяют свою растворимость, осмотическое давление, вязкость и другие свойства под влиянием рН среды. Полагают, что изменение ферментативной активности в зависимости от рН среды связано с изменением ионизации ферментов, суб­страта или фермент-субстратного комплекса .

Ферменты проявляют оптимальную активность только в определенных, свойственных им пределах рН . Так, пеп­син, который выделяется в сильнокислую среду желудка, имеет оптимум активности при рН 1,5 и 2,5. В то же время протеазы, которые выделяются поджелудочной железой в двенадцатиперстную кишку, имеют оптимальную актив­ность в щелочной зоне рН, а оптимум действия трипсина лежит в пределах рН 8 – 9. При значении рН выше или ниже оптимальной активность ферментов снижается .

Большинство ферментов бывают наиболее активными в нейтральных, слабощелочных или слабокислых средах. По мере сдвига значения рН от оптимальной в кислую или щелочную среду активность ферментов падает.

Активаторы и ингибиторы (парализаторы) ферментов могут соответственно усиливать или ослаблять и даже прекращать их деятельность. Активаторами ферментов являются ионы металлов: Na + , K + , Rb + , Mg 2+ , Ca 2+ , Cu 2+ , Fe 2+ и соединения, содержащие сульфгидрильные группы: SH, HCN, H 2 S . Наличие в растворе указанных металлов или соединений в определенной концентрации способствует проявлению полной активности некоторых фер­ментов.

Все ферменты подвержены ингибированию в ре­зультате денатурации или разрушения ферментного белка .

Сущность действия ингибиторов в большинстве слу­чаев состоит в том, что они соединяются с активными группами или активными центрами молекулы ферментов. Различают ингибиторы общего и специфического ха­рактера . К общим ингибиторам, которые подавляют дей­ствие всех ферментов , относят соли тяжелых металлов (свинца, серебра, ртути), трихлоруксусную кислоту и танин . Часто торможение или прекращение действия фер­ментов под влиянием тяжелых металлов носит обратимый характер, и если в среду добавить вещества, образующие соединения с этими металлами, то активность ферментов восстанавливается.

Специфические ингибиторы действуют только на опре­деленные ферменты. Так, синильная кислота действует только на окислительные ферменты, содержащие в актив­ном центре железо или медь. Синильная кислота вступает в соединение с металлами, и фермент теряет активность.

В живой клетке регулирование действия ферментов осуществляется не только с помощью специфических акти­ваторов и ингибиторов, но также путем связывания фер­ментов на различных коллоидных структурах прото­плазмы. Такое связывание ферментов приводит к потере ими активности. Освобождение фермента из соединения вновь восстанавливает его каталитическую активность.

Ферменты инактивируются при очень высоких давлениях . Однако после снятия давления ферменты восста­навливают свою каталитическую активность.

Действие ферментов сильно замедляется в сухих про­дуктах, однако полностью не прекращается . Результаты активности ферментов могут проявляться в изменении качества продукта – его потемнении, ухудшении аро­мата, вкуса, консистенции и т. д.

Скорость большей части ферментальных реакций про­порциональна концентрации фермента, по крайней мере, на самых ранних стадиях. За пределами начальных ста­дий скорость ферментативных реакций падает.

Фермент образует с субстратом комплекс, который диссоциирует на свободный фермент и конечный продукт реакции:

где Е – фермент; S – субстрат; ЕS – ферментно-субстратный комплекс; Р – конечный продукт.

Количество субстрата очень велико по сравнению с ко­личеством фермента, и поэтому концентрация субстрата сильно влияет на скорость ферментативных реакций. Если субстрат содержится в значительном избытке, то коли­чество образующегося продукта пропорционально вре­мени. По мере уменьшения концентрации субстрата ко­личество образующегося в единицу времени конечного продукта (Р) снижается.

О наличии в растворе фермента судят по его действию. Так, о наличии амилазы в слюне можно судить по спо­собности слюны осахаривать крахмал, о наличии желу­дочного пепсина – по его способности растворять с до­статочной быстротой яичный белок или фибрин.

Регулируя активность ферментов созданием соответствующей реакции среды, можно управлять скоростью катализируемых ими реакций, а также деятельностью ферментов, содержащихся в пищевых продуктах, что позволяет осуществлять мероприятия по хранению зерна, картофеля, плодов и овощей, производству ряда продуктов (вина, чая и т. д.).

Номенклатура и классификация ферментов

В начальный период развития учения о ферментах им давали названия без определенной системы, по случай­ным признакам, по названию субстрата или типу катали­зируемой реакции. Так, фермент пепсин получил назва­ние от греческого слова «пепсис» – перевариваю, папаин – от сока растения папайи, богатого ферментом. Случалось, что отдельные авторы одному и тому же фер­менту давали разные названия.

В связи с бурным развитием науки о ферментах – фер­ментологии в 1961 г. постоянным комитетом по ферментам при Международном биохимическом союзе была разра­ботана современная номенклатура и классификация ферментов. В соответствии с этой классификацией название фермента составлялось из химического названия суб­страта и названия той реакции, которая осуществлялась ферментом. К латинскому названию корня субстрата, на который действует фермент (сахароза – сахараза), или к названию процесса, катализируемого данным ферментом (гидролиз – гидролазы), добавлялось окон­чание «аза» . Наряду с новыми названиями для многих ферментов сохранились старые, прочно вошедшие в науч­ную литературу (пепсин, трипсин, папаин и др.).

По современной классификации все ферменты делят на шесть классов: оксидоредуктазы; трансферазы; гидро­лазы; лиазы; изомеразы; лигазы (синтетазы) . Классифи­кация ферментов основана на характере их действия.

Каждый класс подразделяют на подклассы, а каждый подкласс – на группы .

Оксидоредуктазы

Это ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции , которые проис­ходят в живых организмах. Реакции окисления веществ в организмах всегда сопровождаются реакциями восста­новления. Оксидоредуктазы делят на 14 подклассов (наиболее обширный класс ферментов).

Окисление протекает как процесс отнятия водорода (электронов) от субстрата, а восстановление – как при­соединение атомов водорода (электронов) к акцептору. Эту реакцию схематично можно представить в следующем виде:

АН 2 + В = А + ВН 2 ,

где АН 2 – вещество, отдающее свой водород и называемое донатором; В – вещество, отнимающее водород и назы­ваемое акцептором.

Окислению могут подвергаться разнообразные веще­ства – углеводы, жиры, белки, аминокислоты, вита­мины и др.

Роль оксидоредуктаз в живых тканях выполняют об­ширные группы дегидрогеназ и оксидаз , которые носят название в зависимости от окисляемого ими субстрата. Так, фермент, дегидрирующий яблочную кислоту, назы­вается малатдегидрогеназой, дегидрирующий этиловый спирт – алкогольдегидрогеназой и т. д.

В классе оксидоредуктаз основное значение имеют дегидрогеназы, которые осуществляют реакцию дегидри­рования. Все дегидрогеназы делят на две группы : анаэроб­ные и аэробные, которые называют оксидазами .

Анаэробные дегидрогеназы представляют собой спе­цифические ферменты, катализирующие отщепление водо­рода от определенных химических веществ и передающие его другим ферментам – переносчикам водорода. Эти де­гидрогеназы являются двухкомпонентными ферментами, в которых кофермент легко отделяется от белковой части. В качестве кофермента в состав анаэробных дегидрогеназ могут входить два вещества – никотин-амид-аденин-нуклеотид (НАД ) или никотин-амид-аделинин-нуклеотид-фосфат (НАДФ ). Оба эти вещества обладают исключительно вы­сокой реакционной окислительно-восстановительной спо­собностью.

Известно очень много анаэробных дегидрогеназ, ката­лизирующих окисление различных органических соедине­ний. Так, лактатдегидрогеназа катализирует реакцию окисления молочной кислоты до пировиноградной, изоцитратдегидрогеназа – окисление изолимонной кислоты до щавелево-янтарной.

К группеаэробных дегидрогеназ (оксидаз) относят ферменты, в состав которых в качестве кофермента входит витамин В 2 , (рибофлавин ), поэтому такие ферменты назы­вают флавиновыми . Флавиновые ферменты способны отни­мать водород от окисляемого вещества и передавать его другим соединениям или кислороду воздуха:

2Н 2 О 2 → 2Н 2 О + О 2 .

Отнимая водород от окисляемого вещества и передавая его кислороду воздуха, оксидаза может при этом образо­вывать воду или перекись водорода (Н 2 О или Н 2 О 2). К этой группе ферментов относятся полифенолоксидаза, аскорбинатоксидаза, глюкооксидаза.

Полифенолоксидаза представляет собой аэробную дегидрогеназу, для которой акцептором водо­рода является газообразный кислород .

Она действует на о-дифенолы, полифенолы, дубильные вещества и тирозин. Полифенолоксидаза широко распро­странена в грибах и высших растениях, особенно ее много в зеленом чайном листе. Действием полифенолоксидазы объясняется потемнение на разрезе мякоти плодов и ово­щей, картофеля, а также потемнение свежего чайного листа при его скручивании. Полифенолоксидаза играет большую роль в качестве промежуточного звена при дыха­нии растений.

Фермент пероксидаза наряду с полифенолоксидазой и цито­хромоксидазой активно участвует в процессах дыхания растений и защитных реакциях растений против фитопатогенных микроорганизмов растений.

Активная группа пероксидазы содержит железо . С по­мощью фермента пероксидазы за счет перекиси водорода и некоторых других органических перекисей происходит окисление органических соединений. Пероксидаза обра­зует комплексное органическое соединение, вследствие чего перекись активируется и приобретает способность действовать как акцептор водорода:

Многие органические соединения реагируют с кисло­родом воздуха и образуют перекиси. Особенно легко обра­зуются перекиси при окислении кислородом воздуха соединений, имеющих непредельные связи: каротиноидов, ненасыщенных жирных кислот, некоторых углеводородов.

Фермент каталаза катализирует процесс расщеп­ления перекиси водорода на воду и кислород:

В состав молекулы каталазы, как и пероксидазы, вхо­дит железо . Главное назначение каталазы в организме состоит в том, что она разрушает вредную для клеток перекись водорода, образующуюся в процессе дыхания.

Фермент липоксигеназа катализирует образо­вание перекисей и гидроперекисей при окислительной порче жиров.

C точки зрения эффективности применения биокатализаторов было бы крайне заманчиво не только повысить стабильность ферментов, но и научиться возвращать активность отработанным в ходе технологического процесса ферментативным препаратам.

Практически одновременно с обнаружением феномена инактивации ферментов (начало ХХ в.) исследователи стали предпринимать попытки их реактивации. К настоящему времени накоплено довольно много положительных примеров в этом направлении. Их удобно классифицировать согласно причинам, вызывающим инактивацию.

Реактивация агрегированных белков . Ее часто удается осуществить, разрушив межмолекулярные нековалентные контакты (гидрофобные, электростатические, водородные связи). Для этого используют те же денатуранты, которые разрушают нековалентные взаимодействия в нативных белках, вызывая их обратимую денатурацию: концентрированные растворы мочевины и гуанидин хлорида‚ экстремальные значения рН и т. п.

Реактивация белков с измененной первичной структурой . Если белок потерял активность в результате химической модификации функциональных групп, то можно попытаться реактивировать его с помощью обратной химической реакции. Ферменты, инактивированные путем модификации SH-групп (например, их окислением), иногда удается реактивировать, добавляя избыток низкомолекулярного тиола или другого восстановителя.

Десорбция инактивированного белка со стенок сосуда . «Сорбционная инактивация» белков обусловлена слабыми нековалентными взаимодействиями (электрическими, гидрофобными, водородными связями) между белком и поверхностью реакционной ячейки. Реактивация в этом случае достигается за счет разрушения неспецифических взаимодействий при экстремальных значениях pH, под действием концентрированных растворов мочевины или гуанидин хлорида и других реагентов, являющихся «обратимыми денатурантами» для большинства белков.

Реактивация «необратимо денатурированного» белка . Реактивацию удается провести, руководствуясь следующей двухстадийной схемой: сначала в инактивированном белке следует разрушить все, в том числе ненативные нековалентные взаимодействия, т. е. перевести белок в развернутое состояние и уже из этого состояния попытаться свернуть его в нативную конформацию. Таким образом, в общем случае задача о реактивации какого-либо «необратимо денатурированного» фермента, по существу, свалится к решению двух задач. Во-первых, поиску условий, при которых инактивированный белок удается развернуть. Для разворачивания инактивированных белков обычно используют те же реагенты, с помощью которых нативные (неинактивированные) белки можно перевести в состояние статистического клубка. Это концентрированные растворы обратимых денатурантов (мочевины или гуанидин хлорида). Во-вторых, экспериментальному подбору условий, в которых развернутый белок успешно сворачивается в нативную (каталитически активную) конформацию. Для этой цели часто полезными оказываются эффекторы ферментативной активности (субстраты, ингибиторы, кофакторы и т. п.)‚ которые одновременно являются и эффекторами сворачивания, т. е. повышают выход реактивации фермента.

Регенерация кофакторов (коферментов)

К категории кофакторов относятся коферменты, простетические группы и ионы металлов. С технологической точки зрения наибольший интерес представляет регенерация коферментов. Коферменты - это низкомолекулярные органические соединения, которые играют роль дополнительного субстрата в функционировании многих ферментов.

При использовании систем иммобилизованных ферментов с коферментами приходится решать две задачи: собственно регенерацию кофермента и его удержание в реакционной системе. Последнее обычно осуществляется путем ковалентной иммобилизации коферментов на полимерных носителях. Для регенерации разработано несколько подходов‚ суть которых отражается следующей схемой:

Согласно этой схеме кофермент, изменяющийся в реакции с участием одного из ферментов, благодаря системе сопряженных реакции регенерирует, т.е. принимает свое первоначальное состояние. В зависимости от типа сопряженной реакции все способы регенерации коферментов можно разделить на две группы: ферментативные и неферментативные. К ферментативным относятся способы регенерации с использованием сопряженных субстратов или сопряженных ферментов. Неферментативные пути можно подразделить на химические и электрохимические.

Система регенерации ATP – это непрерывный процесс превращения АДФ в АТФ, катализаторами в котором выступают ферменты, фосфорилирующие дифосфат, используя в качестве доноров фосфата фосфатсодержащие соединения (ацетилфосфат, креатинфосфат, аргининфосфат и т.д.).